植物染色質(zhì)免疫沉淀分析（CHIP）試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

植物染色質(zhì)免疫沉淀分析（CHIP）試劑是一種旨在通過甲醛交聯(lián)、物理或化學(xué)處理細胞核以及染色質(zhì)，從而運用特異抗體結(jié)合免疫沉淀，然后萃取DNA，擴增分析，來確定結(jié)合蛋白的目標DNA序列的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。其適用于DNA復(fù)制、重組、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、病毒組裝中的DNA和蛋白質(zhì)（包括轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶、組蛋白等）的相互作用的研究。廣泛應(yīng)用于定性檢測各種植物組織（花瓣、葉片、種子等）DNA蛋白結(jié)合序列和定量檢測序列特異性DNA結(jié)合蛋白（例如轉(zhuǎn)錄因子）及其突變形成等。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，反應(yīng)敏感，結(jié)合顯著，重復(fù)性好。

技術(shù)背景

DNA和蛋白質(zhì)的相互作用是調(diào)控細胞反應(yīng)過程的要素之一。染色質(zhì)免疫沉淀分析方法（chromatin immunoprecipitation；CHIP）是研究活體內(nèi)（in vivo）DNA和蛋白質(zhì)的相互作用的有力的工具：用于分析染色質(zhì)結(jié)構(gòu)動力學(xué)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、以及表觀遺傳學(xué)變異等。CHIP技術(shù)通過三大步驟實現(xiàn)：*，甲醛固定后染色質(zhì)分離和斷片；第二，運用特異蛋白之抗體，免疫共沉淀結(jié)合蛋白（包括轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶、組蛋白等）的染色質(zhì)片斷；第三，分析目標DNA和蛋白的修飾。其中轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)節(jié)蛋白，通過結(jié)合核DNA，以達到控制基因表達。

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存裂解液A（Reagent D）、裂解液B（Reagent E）、裂解液C（Reagent F）、核溶液（Reagent G）、稀釋液（Reagent H）、結(jié)合液（Reagent I）、解聯(lián)液（Reagent O）、酶解液（Reagent P）、萃取液（Reagent Q）、濃縮液（Reagent R）和擴增液（Reagent U）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 有效保證6月

用戶自備

特異抗體：用于目標蛋白的結(jié)合

特異引物：用于目標DNA的擴增或測序

1.5毫升離心管：用于樣品反應(yīng)操作和保存的容器

2毫升離心管：用于樣品反應(yīng)操作和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

50毫升錐形離心管：用于植物組織處理的容器

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

震蕩器：用于混勻反應(yīng)物

4℃微型臺式離心機：用于沉淀樣品

4℃臺式離心機：用于沉淀樣品

平式搖蕩儀或搖床：用于孵育和混勻反應(yīng)

DOUNCE勻漿器：用于裂解植物組織細胞

超聲儀：用于裂解植物組織細胞核

PCR儀：用于擴增反應(yīng)

電泳儀：用于檢測擴增產(chǎn)物

實驗步驟

實驗開始前，準備好待測植物的預(yù)處理：藥物處理等。同時將－20℃保存的試劑置于冰槽里融化。然后進行下列操作。

一、 植物組織細胞核分離

1． 準備好新鮮處理的植物組織（花瓣、葉片、種子等），并秤重1克組織重量

2． （選擇步驟）放進預(yù)冷的50毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入 毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 或置于液氮管過一夜，次日取出后，即刻（快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）

6． 放進15毫升錐形離心管

7． 加入 毫升室溫預(yù)熱的固著液（Reagent B）

8． 平放置于搖床，室溫下（25℃）孵育15分鐘，速度為100RPM

9． 加入 微升室溫預(yù)熱的終止液（Reagent C）

10．繼續(xù)平放置于搖床，室溫下（25℃）孵育5分鐘，速度為100RPM

11．放進臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g

12．小心抽去上清液

13．加入 毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻

14．放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g

15．小心抽去上清液

16．重復(fù)實驗步驟13至15二次

17．加入 毫升預(yù)冷的裂解液A（Reagent D），混勻

18．渦旋震蕩5秒，充分混勻

19．置于冰槽里孵育10分鐘

20．即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

21．在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）（注意：參見注意事項6）

22．（選擇步驟）準備1個小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲，置于15毫升錐形離心管上

23．（選擇步驟）將所有組織勻漿物移入到小型漏斗里過濾

24．將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管

25．放進4℃臺式離心機離心20分鐘，速度為2000g

26．小心抽去上清液

27．加入 毫升裂解液B（Reagent E），混勻顆粒群

28．轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管

29．放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）

30．小心抽去上清液

31．加入 微升裂解液C（Reagent F），混勻顆粒群

32．準備1個新的1.5毫升離心管

33．加入 微升裂解液C（Reagent F）

34．小心加入 微升上述樣品懸液在裂解液C（Reagent F）的上面

35．放進4℃微型臺式離心機離心60分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）

36．小心抽去上清液

37．加入 毫升核溶液（Reagent G），混勻顆粒群

38．置于冰槽里孵育10分鐘

39．置于200瓦超聲儀下，功率50％，猝擊20秒，間隙10秒冷卻，重復(fù)3次（注意：根據(jù)DNA的片段大小，增加超聲次數(shù)）

40．放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）

41．小心移取上清液分裝到10個2毫升離心管（100微升/管）

42．其中： 1）選擇1管進行1：50稀釋后，測定OD260，確定DNA含量，使所有樣品的檢測濃度調(diào)整一致（注意：建議OD260＝0.1為佳）

2）或選擇1管進行蛋白濃度檢測，使所有樣品的檢測濃度調(diào)整一致（注意：蛋白總量1至5毫克為佳；

3）或選擇1管進行去交聯(lián)以及電泳鑒定超聲處理的DNA片段（0.3至1.5kb）（注意：參見注意事項7）

43．選擇1管繼續(xù)后續(xù)操作，其余的保存在－70℃冰箱里

44．加入 微升稀釋液（Reagent H）

二、 結(jié)合反應(yīng)

1． 加入 微升結(jié)合液（Reagent I）

2． 平放置于4℃搖床孵育1小時，速度為100RPM

3． 放進4℃微型臺式離心機離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心移取上清液到2個新的2毫升離心管（每管500微升：1管為無抗體對照；1管為抗體處理管）

5． 加入50微升用戶自備的特異抗體（總量為5微克）到抗體處理管

6． 將對照和抗體管平放置于4℃搖床孵育16小時，速度為100RPM

7． 加入 微升結(jié)合液（Reagent I）到抗體處理管

8． 將對照和抗體管平放置于4℃搖床孵育2小時，速度為100RPM

9． 將抗體管放進4℃微型臺式離心機離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

10．小心抽去上清液

11．加入 毫升低鹽液（Reagent J）到抗體管，混勻

12．平放置于4℃搖床孵育5分鐘，速度為100RPM

13．放進4℃微型臺式離心機離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

14．小心抽去上清液

15．加入 毫升高鹽液（Reagent K）到抗體管，混勻

16．平放置于4℃搖床孵育5分鐘，速度為100RPM

17．放進4℃微型臺式離心機離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

18．小心抽去上清液

19．加入 毫升平衡液（Reagent L）到抗體管，混勻

20．平放置于4℃搖床孵育5分鐘，速度為100RPM

21．放進4℃微型臺式離心機離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

22．小心抽去上清液

23．加入 毫升緩沖液（Reagent M）到抗體管，混勻

24．平放置于4℃搖床孵育5分鐘，速度為100RPM

25．放進4℃微型臺式離心機離心1分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

26．小心抽去上清液

27．重復(fù)實驗步驟23至26一次

28．加入 微升洗脫液（Reagent N）到抗體管，混勻

29．平放置于搖床，室溫下孵育15分鐘，速度為100RPM

30．放進4℃微型臺式離心機離心3分鐘，速度為400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

31．小心移取上清液到新的2毫升離心管

32．重復(fù)實驗步驟28至31一次

33．小心移取上清液合并到上述2毫升離心管（注意：可以暫時停止，存放在－20℃，次日繼續(xù)）

三、 DNA萃取

1． 分別加入 微升解聯(lián)液（Reagent O）到抗體處理管和無抗體對照管，混勻

2． 置于65℃恒溫水槽孵育2小時

3． 分別加入 微升酶解液（Reagent P）

4． 置于55℃恒溫水槽孵育2小時

5． 室溫下靜置15分鐘

6． 分別加入 微升萃取液（Reagent Q）（注意：使用前搖勻）

7． 渦旋震蕩15秒

8． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

9． 分別移出450微升上層液相溶液到2個新的2毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）

10．分別加入 微升濃縮液（Reagent R）到新的離心管

11．分別加入 毫升沉淀液（Reagent S）

12．渦旋震蕩15秒

13．放進微型臺式微型離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）

14．小心抽掉上清液

15．分別加入 毫升凈化液（Reagent T）

16．放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

17．小心抽掉上清液

18．空氣中晾干沉淀顆粒群

19．分別加入 微升緩沖液（Reagent M）

20．溶解后放進－20℃冰箱保存

四、 PCR擴增

1． 將擴增液（Reagent U）和補充液（Reagent V）從－20℃冰箱里取出

2． 置入冰槽里直至融化

3． 針對一個樣本，每次移出 微升擴增液（Reagent U）到PCR管

4． 加入2微升上述結(jié)合實驗中獲得的DNA樣品（總量100納克）

5． 分別加入1微升用戶自備的特異性的引物F和引物R（各350納克或25微摩爾）

6． 再加入 微升補充液（Reagent V）（反應(yīng)總量為25微升）

7． 即刻放進微型臺式離心機瞬時離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）

8． 加入50微升PCR級礦物油（注意：參見注意事項9）

9． 即刻進行熱啟動PCR反應(yīng)：

10．反應(yīng)完畢后，移取5微升進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳

11．如果進行測序鑒定，膠回收PCR產(chǎn)物（建議使用高質(zhì)純化一步法膠回收試劑盒；

12．分別移出2微升反應(yīng)液到2個不同的新的1.5毫升離心管（每微升100納克）

13．加入1微升用戶自備的特異性巢式引物F（每微升350納克）到其中一個1.5毫升離心管，作好標記

14．加入1微升用戶自備的特異性巢式引物R（每微升350納克）到另一個1.5毫升離心管，作好標記

15．進行后續(xù)的直接測序反應(yīng)

注意事項

1． 本產(chǎn)品為10次（1克植物組織樣本）操作

2． 操作時，須戴手套

3． 固著處理必須在室溫下進行，其余的操作均須在4℃狀態(tài)進行

4． 嚴格按照操作規(guī)程進行

5． 建議使用無抗體對照

6． 通常勻化次數(shù)為80下達到80％的組織細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的組織細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)

7． 通常超聲處理后的DNA片段大小為0.3至1.5kb；如果使片段小于1.0kb，增加超聲次數(shù)或功率即可。電泳鑒定前，加入10微升解聯(lián)液（Reagent O）到1管100微升超聲處理后樣品，65℃孵育4小時，移取20微升進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳。其標準片段電泳圖象如下：泳道1為DNA標準樣；泳道2為未經(jīng)超聲處理樣品；泳道3為超聲處理后樣品；泳道4為強化超聲處理后樣品 

8． 根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）

9． 建議使用軟件測算Tm溫度；參考公式為Tm=4（G+C）+2（A+T）

10．在－20℃冰箱里儲存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融

11．本公司提供系列CHIP分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶