主要用途 乳酸脫氫酶（LDH）釋放法細(xì)胞繁殖與毒性定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)酶聯(lián)連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)由于細(xì)胞損 傷導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的乳酸脫氫酶釋放到細(xì)胞外，使四唑鹽染料碘硝基氯化四氮唑（INT）還原為紅色甲臜 （farmazan），即比色法定量測(cè)定酶活性，以評(píng)價(jià)活體細(xì)胞繁殖的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心 研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種藥物、化學(xué)、環(huán)境因子和營(yíng)養(yǎng)因子處理的貼壁或懸浮生長(zhǎng)中的動(dòng)物或人 體細(xì)胞。替代傳統(tǒng)的同位素[51 Cr]釋放檢測(cè)的。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，簡(jiǎn)捷敏感，性能穩(wěn)定， 顯色清晰，檢測(cè)準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

技術(shù)背景 細(xì)胞凋亡或壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損害或*裂解導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放外泄到培養(yǎng)液里，其中包括活 性穩(wěn)定的乳酸脫氫酶。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）釋放法的測(cè)定是基于在乳酸脫氫酶的作用 下，還原NAD+反應(yīng)生成的NADH，再與氧化型2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-苯四唑（Iodonitrotetrazolium； INT）在硫辛酰胺脫氫酶（diaphorase）的催化下反應(yīng)生成紅色生色產(chǎn)物甲臜（formazan），在490nm波長(zhǎng)下產(chǎn) 生吸收峰，從而確定釋放的乳酸脫氫酶的活性，作為細(xì)胞膜完整性的標(biāo)志：吸光值與細(xì)胞死亡或毒性程度成 線性正相關(guān)。酶聯(lián)連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容 裂解液（Reagent A） 毫升 補(bǔ)充液（Reagent B） 毫升 反應(yīng)液（Reagent C） 毫升 顯色液（Reagent D） 毫升 終止液（Reagent E） 毫升 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F） 微升（另購(gòu)） 產(chǎn)品說(shuō)明書 1 份

保存在－20℃冰箱里，反應(yīng)液（Reagent C）和顯色液（Reagent D）避免光照；有效保證 6 月

96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于細(xì)胞操作的容器 細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng) 孔板離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞 酶標(biāo)儀：用于定量檢測(cè)染色后的細(xì)胞

1． 準(zhǔn)備 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測(cè)細(xì)胞（每孔 100 微升）：包括未處理的對(duì)照細(xì)胞（樣品對(duì)照孔），未處理的 后續(xù)裂解的細(xì)胞（樣品最大酶活性對(duì)照孔），以及藥物處理的細(xì)胞（處理樣品孔），并做好標(biāo)記（細(xì)胞密 度為每孔 2 X 103 至 2 X 104細(xì)胞） 

2． 到規(guī)定的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前 1 小時(shí)，從濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出待測(cè)的 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（注意：確保細(xì)胞培 養(yǎng)液維持在 100 微升容量） 3． 加入 xx 微升裂解液（Reagent A）到未處理的后續(xù)裂解的細(xì)胞孔里（樣品最大酶活性對(duì)照孔） 

4． 同時(shí)加入 xx 微升補(bǔ)充液（Reagent B）到其余所有檢測(cè)孔里 

5． 放回濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱里，繼續(xù)培養(yǎng) 1 小時(shí)，即規(guī)定檢測(cè)時(shí)間 

6． 從濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出待測(cè)的 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 

7． 放進(jìn)孔板離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 250g 

8． 分別小心移取 50 微升上清液到新的 96 孔板的相應(yīng)孔里，避免觸摸細(xì)胞顆粒，同時(shí)注意做好標(biāo)記 

9． 分別加入 xx 微升反應(yīng)液（Reagent C）（注意：使用前，須混勻） 

10．分別加入 xx 微升顯色液（Reagent D） 

11．搖動(dòng) 96 孔板混勻 

12．在室溫下孵育 30 分鐘，避免光照 

13．（選擇步驟）分別加入 xx 微升終止液（Reagent E） 

14．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀里測(cè)讀：波長(zhǎng) 490nm 

15．計(jì)算處理樣品實(shí)際吸光讀數(shù)：處理樣品孔吸光讀數(shù)－樣品對(duì)照孔吸光讀數(shù) 

16．計(jì)算樣品細(xì)胞最大酶活性的實(shí)際吸光讀數(shù)：樣品最大酶活性對(duì)照孔吸光讀數(shù)－樣品對(duì)照孔吸光讀數(shù) 

17．計(jì)算細(xì)胞毒性或死亡率（％）： （處理樣品實(shí)際吸光讀數(shù)÷樣品細(xì)胞最大酶活性的實(shí)際吸光讀數(shù)）X 100 18．或繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為實(shí)際吸光讀數(shù)（A）；橫坐標(biāo)（X 軸）為細(xì)胞數(shù)或時(shí)間點(diǎn)或藥物 濃度；據(jù)此計(jì)算其 LD50