技術(shù)背景

多聚ADP核糖聚合酶-1（Poly (ADP-ribose) Polymerase；PARP；EC 2.4.2.30）是一種鋅依賴性核酶，廣泛存在于真核細(xì)胞中。PARP家屬由18個(gè)成員，其中6個(gè)已經(jīng)被證實(shí)，包括PARP-1（占90％）、PARP-2、PARP-3、PARP-4（VPARP）、PARP-5a/5b（tankyrase）等。PARP蛋白由4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：DNA結(jié)合、切離、自修飾（automodification）、催化等結(jié)構(gòu)域。其功能在于特異性地識(shí)別DNA損傷產(chǎn)生的單鏈或雙鏈DNA斷裂，并與之結(jié)合而激活，催化將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）轉(zhuǎn)化成煙酰胺（nicotinamide）和多聚ADP核糖分枝聚合體（branched polymers of various poly (ADP-ribose)）的反應(yīng)，由此引導(dǎo)各種DNA修復(fù)蛋白聚集到損傷部位，實(shí)施修復(fù)，同時(shí)調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)形成（chromatin structure formation）、 細(xì)胞分化、繁殖、發(fā)育、凋亡、基因表達(dá)等，以及對(duì)于心腦缺血的反應(yīng)和腫瘤惡變的作用。抑制PARP活性，可以防止心衰、中風(fēng)、敗血癥等引起的組織損害。其中PARP-1由1014氨基酸殘基組成，分子量113Kd，是細(xì)胞ATP/NAD細(xì)胞凋亡系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子。基于人工合成底物ADP核糖對(duì)硝基苯酚（ADP-ribose-p-nitrophenol），在損傷的DNA存在的前提下，受到多聚ADP核糖聚合酶-1的作用，釋放出顯色產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol），通過(guò)分光光度儀檢測(cè)吸光讀數(shù)的變化（405nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量分析多聚ADP核糖聚合酶-1的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）        毫升

緩沖液（Reagent C）        毫升

反應(yīng)液（Reagent D）        微升

底物液（Reagent E）          微升

陰性液（Reagent F）          微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)              1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、 樣品準(zhǔn)備（總蛋白制備）

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)405nm，并置零 

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液（Reagent E）避免光照；緩沖液（Reagent C）室溫下預(yù)熱

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 加入xx微升陰性液（Reagent F）

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻

6． 在25℃溫度下孵育2小時(shí)

7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景讀數(shù)

四、 樣品測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 加入5微升待測(cè)樣品（（20微克核蛋白或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白））（注意：樣品須清澈）

5． 上下傾倒數(shù)次，混勻

6． 在25℃溫度下孵育2小時(shí)

7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)

五、計(jì)算樣品活性

六、 酶標(biāo)板測(cè)定

1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3． 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升底物液（Reagent E）

5． 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測(cè)樣品（20微克核蛋白或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）

6． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

7． 在25℃溫度下孵育2小時(shí)

8． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得背景讀數(shù)和樣品讀數(shù)

9． 活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次

4． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

5． 用戶可以選擇使用核蛋白替代產(chǎn)品中的總蛋白制備

6． 測(cè)定值由低到高變化；反應(yīng)可持續(xù)2小時(shí)

7． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗

8． 樣本測(cè)定2小時(shí)讀數(shù)高于背景讀數(shù)表明具有酶活性

9． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度：核蛋白為20微克/5微升；總蛋白為100微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

10． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

11． 多聚ADP核糖聚合酶-1單位活性定義為：在25℃，pH 8.0條件下，每小時(shí)內(nèi)能夠釋放1微摩爾對(duì)硝基苯酚所需的酶量作為一個(gè)活性單位

12． 本公司提供系列細(xì)胞酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感