主要用途

細(xì)胞膜流動(dòng)性（fluidity）PDA 熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)苯并芘癸酸熒光染料，選擇性地與細(xì)胞膜整合，

并與之產(chǎn)生空間交互作用，形成激基締合物，其熒光散發(fā)波長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移，即熒光比值的增強(qiáng)或減弱，來(lái)分析

膜流動(dòng)性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種人體或動(dòng)物貼

壁或懸浮細(xì)胞膜流動(dòng)性的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，活體檢測(cè)，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)微管以及微絲的動(dòng)力學(xué)特征和微泡和囊泡內(nèi)脂質(zhì)的流動(dòng)動(dòng)力學(xué)，即流變學(xué)（rheological）細(xì)

胞功能，受到細(xì)胞膜流動(dòng)性（fluidity）或粘性（viscosity）調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞膜酶系的活化，微管和微絲的特

定裝配或流動(dòng)，化學(xué)引誘物受體親和力的強(qiáng)化，膜結(jié)構(gòu)和功能的作用等。一旦調(diào)節(jié)失衡，會(huì)導(dǎo)致病理演變

或膜性變異。苯并芘癸酸（pyrenedecanoic acid；PDA）為多環(huán)芳香烴（polycyclic aromatic hydrocarbon）化

合物，一種親脂性苯并芘熒光探針染料，用于膜生物物理學(xué)研究：第一，具有親脂性； 第二，與細(xì)胞膜脂

質(zhì)具有類似性（analog），可以與細(xì)胞膜整合；第三，進(jìn)入膜結(jié)構(gòu)空間后，與之產(chǎn)生交互作用，形成激基締

合物（eximer），其熒光散發(fā)波長(zhǎng)由372nm轉(zhuǎn)移到470nm，通過(guò)締合物和單體的熒光比值（ratio），分析膜流

動(dòng)性強(qiáng)弱，包括動(dòng)力學(xué)，影響因子等。

產(chǎn)品內(nèi)容

染色液（Reagent A）

微升

稀釋液（Reagent B）

毫升

清理液（Reagent C）

毫升

強(qiáng)化液（Reagent D）

微升

產(chǎn)品說(shuō)明書

1 份

保存方式

保存清理液（Reagent C）在 4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有

效保證 6 月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離操作

細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于細(xì)胞脫落操作

1.5 毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光定性分析

比色皿或黑色 96 孔板：用于熒光定量分析的容器熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析

細(xì)胞流式儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent B）

和強(qiáng)化液（Reagent D）放進(jìn) 25℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后分別移出 xx 微升染色液（Reagent A）和 xx 微升

強(qiáng)化液（Reagent D）到新的 1.5 毫升離心管，加入 980 微升稀釋液（Reagent B），混勻后，在冰槽里靜置

（共 5 次操作量），并標(biāo)記為染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

一、直接法

1． 準(zhǔn)備 1 個(gè) 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測(cè)細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá) 70％（約 1 X 10 5細(xì)胞數(shù)）

2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液

3． 輕輕沿著孔壁加入 xx 微升 清理液（Reagent C）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

4． 小心抽去清理液（Reagent C）

5． 加入 xx 微升含有染色液（Reagent A）、稀釋液（Reagent B）和強(qiáng)化液（Reagent D）的染色工作液，

覆蓋培養(yǎng)孔表面

6． 放進(jìn) 25℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里，孵育 20 分鐘（注意避光）

7． 小心抽去染色工作液

8． 小心加入 xx 微升清理液（Reagent C）

9． 小心抽去清理液（Reagent C）

10．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 8 至 9 一次

11．小心加入 xx 微升清理液（Reagent C）

12．選擇下列檢測(cè)：

一、 即刻在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察

1） 單體熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長(zhǎng) 350nm，散發(fā)波長(zhǎng) 370nm，干涉濾波器 405nm 波長(zhǎng) ）――

可見(jiàn)淺藍(lán)色熒光；如果強(qiáng)度明顯，表明膜流動(dòng)性減弱

2） 激基締合物（eximer）熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長(zhǎng) 350nm，散發(fā)波長(zhǎng) 470nm）――可見(jiàn)

深藍(lán)色熒光；如果強(qiáng)度顯著減弱，表明膜流動(dòng)性減弱

二、即刻在熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng) 350nm，散發(fā)波長(zhǎng) 370nm 和 470nm）：獲得相對(duì)熒光單位

（relative fluorescence unit；RFU）以及 RFU470/RFU370 的比值：比值高，膜流動(dòng)性強(qiáng)

二、間接法

1． 準(zhǔn)備 1 個(gè) 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測(cè)細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá) 70％（約 2 X 10 6細(xì)胞數(shù)）

2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液

3． 加入 xx 毫升 清理液（Reagent C）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

4． 小心抽去 xx 毫升 清理液（Reagent C）

5． 加入 500 微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔表面

6． 置入 37℃培養(yǎng)箱 1 分種

7． 輕輕抖動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞脫落，然后加入 1 毫升用戶自備的細(xì)胞培養(yǎng)液

8． 移入 1.5 毫升離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步開(kāi)始）

23

9． 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 1000g

10．小心抽去上清液

11．加入 xx 微升含有染色液（Reagent A）、稀釋液（Reagent B）和強(qiáng)化液（Reagent D）的染色工作液

12．用 200 微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細(xì)胞顆粒群

13．放進(jìn) 25℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里，孵育 20 分鐘（注意避光）

14．放進(jìn)微型臺(tái)式微型離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 1000g

15．小心抽去上清液

16．加入 xx 微升清理液（Reagent C），混勻細(xì)胞顆粒群

17．放進(jìn)微型臺(tái)式微型離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 1000g

18．小心抽去上清液

19．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟 16 至 18 一次

20．加入 xx 微升清理液（Reagent C），混勻細(xì)胞顆粒群

21．進(jìn)行下列檢測(cè)

選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀察

1． 混勻后，移出 50 微升在載玻片上

2． 即刻進(jìn)行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：

1） 單體熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長(zhǎng)350nm，散發(fā)波長(zhǎng)370nm，干涉濾波器405nm 波長(zhǎng) ）――

可見(jiàn)淺藍(lán)色熒光；如果強(qiáng)度明顯，表明膜流動(dòng)性減弱

2）激基締合物（eximer）熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長(zhǎng) 350nm，散發(fā)波長(zhǎng) 470nm）――可見(jiàn)

深藍(lán)色熒光；如果強(qiáng)度顯著減弱，表明膜流動(dòng)性減弱

選擇二、細(xì)胞流式儀分析

1. 混勻后，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：觀察 5000 個(gè)細(xì)胞以上

激發(fā)波長(zhǎng)

360nm

熒光顏色

藍(lán)色

散發(fā)波長(zhǎng)

單體波長(zhǎng) 400nm 和締合物波長(zhǎng) 450nm

（70nm 波寬）

熒光變化

建立象限圖/散點(diǎn)圖

選擇三、熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 混勻后，移出 100 微升到黑色 96 孔板里或 100 微升比色皿里

2． 即刻進(jìn)行熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測(cè)定（激發(fā)波長(zhǎng) 350nm，散發(fā)波長(zhǎng) 370nm 和 470nm）：獲得相

對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）以及 RFU470/RFU370 的比值：比值高，膜流動(dòng)性強(qiáng)

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為 20 次（0.2 毫升工作液）操作2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 待測(cè)細(xì)胞建議不要過(guò)于饑餓或過(guò)度生長(zhǎng)

4． 操作時(shí)，避免污染母液，尤其是稀釋液（Reagent B）

5． 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析

6． 孵育時(shí)，避免光照

7． 本公司提供系列膜流動(dòng)性檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰