精子頂體形態(tài)刀豆素A凝集素?zé)晒鈽?biāo)記（ConA-FITC）染色試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

精子頂體形態(tài)刀豆素A凝集素?zé)晒鈽?biāo)記（ConA-FITC）染色試劑是一種旨在使用熒光素標(biāo)記的刀豆素A凝集素和赫斯特33258雙重?zé)晒?/span>染色技術(shù)，分析生理性反應(yīng)性或病理性退行性頂體缺失的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種動(dòng)物（例如猴、豬等）或人體精子細(xì)胞以及凍存精子細(xì)胞，包括睪丸中、附睪中以及射精后的精子細(xì)胞的頂體狀態(tài)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡便，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

技術(shù)背景

在男科學(xué)（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子壽命、以及生育能力的基礎(chǔ)信息。其中精子的活力（vitality）、運(yùn)動(dòng)能力（motility）、授精潛力（fertilizing potential）、膜結(jié)構(gòu)或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性（integrity）、頂體反應(yīng)（acrosomal reaction）功能的評(píng)價(jià)是精子分析的重要指標(biāo)，也是決定人工受孕或體外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要參數(shù)。其中頂體反應(yīng)，是指當(dāng)精子接近卵子實(shí)施授精時(shí)，精子頭部前半端的帽狀結(jié)構(gòu)頂體，釋放出溶解酶，以便精子和卵子的膜融合。頂體反應(yīng)測試是一項(xiàng)穩(wěn)定的精子功能參數(shù)，可以用于預(yù)測受精成功率。因此頂體的結(jié)構(gòu)完整性（intact）是評(píng)價(jià)的主要標(biāo)志，也是不育癥和避孕藥物研究的對(duì)象。使用熒光素標(biāo)記的無毒性的刀豆素A凝集素（Isothiocyano fluoresceinated -Concanavalin A；ConA-FITC）和赫斯特33258（Hoechst 33258）雙重?zé)晒?/span>染色技術(shù)，是精子頂體反應(yīng)分析和授精效率評(píng)價(jià)的的方法。首先使用赫斯特33258染色，分析精子活力，基于赫斯特33258具有有限的膜通透性特點(diǎn)，受到活體精子細(xì)胞（包括游動(dòng)性和非游動(dòng)性精子）的排斥，而容易進(jìn)入死亡精子細(xì)胞。其次使用熒光素標(biāo)記的刀豆素A凝集素染料，與頂體內(nèi)膜表面糖復(fù)合物上的葡萄糖或甘露糖糖基的反應(yīng)。當(dāng)頂體內(nèi)容物缺失，使染料與暴露的內(nèi)膜結(jié)合，顯示綠色熒光，即反應(yīng)性（reacted）頂體。雙染的作用，以幫助區(qū)分生理性反應(yīng)性頂體缺失（loss）或病理性退行性頂體缺失。通過常用的熒光顯微鏡（激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長530nm）便可清晰觀察到綠色頂體缺失狀態(tài)（status）。  

產(chǎn)品內(nèi)容

保存液（Reagent A）          毫升

染色液A（Reagent B）         微升

清理液（Reagent C）          毫升

固著液（Reagent D）          毫升

染色液B（Reagent E）         毫升

產(chǎn)品說明書             1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；染色液A和B（Reagent B和E）避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品染色操作的容器

血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：用于細(xì)胞計(jì)數(shù)

載玻片和蓋玻片：用于精子細(xì)胞爬片

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察染色的精子細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

1． 移取新鮮獲得的1毫升精液（48小時(shí)內(nèi)）到1.5毫升離心管

2． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘

3． 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

4． 小心抽去上清液

5． 加入xx毫升保存液（Reagent A），混勻顆粒群

6． 在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)整到2 X 10⁷精子細(xì)胞/毫升

7． 移取100微升精子細(xì)胞到新的1.5毫升離心管

8． 加入xx微升染色液A（Reagent B），混勻

9． 室溫下孵育5分鐘，避免光照

10． 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

11． 小心抽去上清液

12． 加入xx微升清理液（Reagent C），混勻顆粒群

13． 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

14． 小心抽去上清液

15． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟12至14一次

16． 加入xx微升固著液（Reagent D），混勻顆粒群

17． 室溫下孵育60分鐘，避免光照

18． 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

19． 小心抽去上清液

20． 加入xx微升保存液（Reagent A），混勻顆粒群

21． 即刻移取20微升到潔凈的載玻片一端

22． 用蓋玻片或另一個(gè)載玻片推片

23． 置于空氣中涼干

24． 小心加上xx微升染色液B（Reagent E），覆蓋樣品表面

25． 室溫下孵育30分鐘，避免光照

26． 小心抽去染色液

27． 小心加上xx微升清理液（Reagent C），覆蓋樣品表面

28． 小心抽去清理液

29． 蓋上蓋玻片或封片液

30． 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)（注意：每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)精子）

觀察藍(lán)色熒光—染色液A（Reagent B）：濾波器激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長460nm ――可見藍(lán)色熒光，表明死亡精子細(xì)胞

觀察綠色熒光—染色液B（Reagent E）：濾波器激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm ――可見綠色熒光，表明精子頂體區(qū)域

31． 分析結(jié)果

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次操作

2． 本產(chǎn)品可以與各種免疫抗體進(jìn)行雙染

3． 本產(chǎn)品不適合分析精卵細(xì)胞反應(yīng)的頂體狀態(tài)

4． 操作時(shí)須戴手套

5． 樣品檢測前，建議在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行精子細(xì)胞計(jì)數(shù)

6． 精子細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)乘上稀釋倍數(shù)10⁴。標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器（Hemocytometer）的計(jì)算方法是：

1毫米方塊的細(xì)胞計(jì)數(shù)X 10⁴（稀釋倍數(shù)）＝實(shí)際細(xì)胞數(shù)/毫升

7． 染色完成后，即刻進(jìn)行檢測分析

8． 用戶可以使用鈣離子載體A23187或Ionomycin誘導(dǎo)精子頂體缺失

9． 反應(yīng)性頂體（reacted  acrosome）或缺失性頂體（loss）參考圖像如下：

10． 本公司提供系列發(fā)育生物學(xué)相關(guān)檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰