細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光測定試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途
細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑氯甲基二氯二氫熒光素
二乙酯，在細(xì)胞氧化條件下，產(chǎn)生熒光，來定量檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方
法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的?？梢员挥糜诩?xì)胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝和
營養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基
（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧
自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）
次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等
細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二
氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是
取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級產(chǎn)品，一種*
自由通過細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)長期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過氧化氫、羥自由基或氫氧基、過氧
化基、次氯酸等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測定細(xì)胞內(nèi)活性氧族的濃度。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
染色液（Reagent B） 微升
稀釋液（Reagent C） 毫升
保存液（Reagent D） 毫升
產(chǎn)品說明書1 份
保存方式
保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6 月
用戶自備
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HL12024）：用于細(xì)胞脫離
*細(xì)胞培養(yǎng)液（HL12052）：用于細(xì)胞操作所需的培養(yǎng)基
15 毫升錐形離心管：用于細(xì)胞操作的容器
1.5 毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器
血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：用于細(xì)胞計(jì)數(shù)
臺式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞
細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析
（共聚焦）熒光顯微鏡或：用于觀察熒光細(xì)胞
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熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、間接法
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）
放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx 微升染色液（Reagent B）到新的1.5 毫升離心管，加入xx 微升稀
釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。
1． 準(zhǔn)備1 瓶25cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測細(xì)胞
2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
3． 加入xx 毫升清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
4． 小心抽去清理液（Reagent A）
5． 加入1 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)平面
6． 置入37℃培養(yǎng)箱1 分種
7． 振動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
8． 加入4 毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
9． 移入15 毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細(xì)胞直接從這一步驟開始）
10．移取10 微升在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)
11．移出1 X 106 細(xì)胞到新的15 毫升錐形離心管
12．放入臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g
13．小心抽去上清液
14．加入xx 毫升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液，輕柔混勻
15．放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育20 分鐘，避免光照
16．放入臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為300g
17．小心抽去上清液
18．加入預(yù)冷的xx 微升保存液（Reagent D），輕柔混勻細(xì)胞顆粒群
19．放進(jìn)冰槽里
20．選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
a) 即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：波長488nm 氬離子激光，觀察50000 個(gè)細(xì)胞以上――
波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高
b) 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
1）移取10 微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片
2）激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm――
綠色熒光增強(qiáng)，表明活性氧族（ROS）含量高
c) 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：
1）移取400 微升上述細(xì)胞懸液到1 毫升比色杯
2）加入xx 微升保存液（Reagent D）
3）上下傾倒混勻數(shù)次
4）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm――
RFU 增高，表明活性氧族（ROS）含量高
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二、直接法
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）
放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx 微升染色液（Reagent B）到新的1.5 毫升離心管，加入xx 微升稀
釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。
1． 準(zhǔn)備1 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)24 孔板的待測細(xì)胞，細(xì)胞鋪滿率達(dá)70％
（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm 培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項(xiàng)4）
2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
3． 小心沿著孔壁加入xx 微升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液到1 個(gè)細(xì)胞
培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
4． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20 分鐘
5． 小心抽去含有染色工作液的細(xì)胞培養(yǎng)液
6． 小心沿著孔壁加入xx 微升37℃預(yù)熱的保存液（Reagent D）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
7． 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20 次操作
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 孵育時(shí)，必須避免光照
4． 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm 培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)
調(diào)整操作用量：
操作容器操作用量
載玻片100 微升
載玻片培養(yǎng)皿1 毫升
35mm 培養(yǎng)皿1 毫升
96 孔培養(yǎng)板100 微升
48 孔培養(yǎng)板200 微升
24 孔培養(yǎng)板500 微升
12 孔培養(yǎng)板1 毫升
6 孔培養(yǎng)板2 毫升
25cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶3 毫升
5． 根據(jù)細(xì)胞類型，調(diào)整染色工作液使用劑量（1：200 至1：1000 容量比），避免過度染色
6． 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行細(xì)胞熒光分析
7． 本公司提供陽性對照甲萘醌溶液（HL12041），觀察細(xì)胞熒光增強(qiáng)現(xiàn)象
8． 本公司同時(shí)提供細(xì)胞內(nèi)活性氧初級熒光測定試劑盒（HL10016.2），滿足不同用戶需求
9． 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰