精子活力和頂體反應(yīng)三色（triple staining）染色試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
精子活力和頂體反應(yīng)三色（triple staining）染色試劑是一種旨在使用臺盼藍、孟加拉紅和俾斯麥棕Y三種染料特異性著色死亡精子、完整頂體以及頂體后區(qū)，產(chǎn)生藍、紅棕色，從而確定細胞活力以及精子功能（頂體反應(yīng)）的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。適用于各種動物或人體精子細胞。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡便，性能穩(wěn)定，著色清晰。
技術(shù)背景
在學(xué)（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子壽命、以及生育能力的基礎(chǔ)信息。其中精子的活力（vitality）、運動能力（motility）、授精潛力（fertilizing potential）、膜結(jié)構(gòu)完整性（integrity）、頂體反應(yīng)（acrosomal reaction）功能的評價是精子分析的重要指標，也是決定人工受孕或體外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要參數(shù)。其中頂體反應(yīng)，是指當精子接近卵子實施授精時，精子頭部前半端的帽狀結(jié)構(gòu)頂體，釋放出溶解酶，以便精子和卵子的膜融合。頂體反應(yīng)測試是一項穩(wěn)定的精子功能參數(shù)，可以用于預(yù)測受精成功率。因此頂體的結(jié)構(gòu)完整性（intact）是評價的主要標志，也是不育癥和藥物研究的對象。三色（triple staining）染色首先使用臺盼藍（trypan blue）染色，分析精子活力，基于臺盼藍受到活體精子細胞（包括游動性和非游動性精子）的排斥，而死亡精子細胞攝入染料顯示紅色的原理。其次使用孟加拉紅或虎紅（Rose Bengal）染料與頂體內(nèi)含物的結(jié)合，區(qū)別完整性（未反應(yīng)性unreacted）頂體，以及俾斯麥棕Y（Bismark Brown Y）染料識別頂體后區(qū)（post-acrosomal region）染色。通過常用的一般光學(xué)顯微鏡（無需相差顯微鏡；phase-contrast microscope）便可清晰觀察到頂體缺失狀態(tài)。
產(chǎn)品內(nèi)容
一染液（Reagent A） 毫升
清理液（Reagent B） 毫升
固定液（Reagent C） 毫升
二染液（Reagent D） 毫升
三染液（Reagent E） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在4℃冰箱里，避光，有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)
微型臺式離心機：用于樣品操作
血細胞計數(shù)器：用于細胞計數(shù) 1
蓋玻片：用于精子細胞爬片
一般光學(xué)顯微鏡：用于觀察染色的精子細胞
實驗步驟
1． 移取新鮮獲得的精液（30分鐘至1小時內(nèi)）到1.5毫升離心管
2． 放進37℃恒溫水槽孵育30分鐘
3． 輕柔渦旋震蕩5秒
4． 移取xx微升上述精液到新的1.5毫升離心管
5． 加入xx微升一染液（Reagent A）
6． 用200微升槍頭上下抽吸混勻
7． 放進37℃恒溫水槽孵育15分鐘
8． 即刻移取xx微升到潔凈的載玻片
9． 蓋上蓋玻片
10．即刻在一般光學(xué)顯微鏡下（1000倍；即油鏡下）觀察并計數(shù)（注意：每個視野計數(shù)200個精子）
藍色染色的精子細胞為死亡細胞，而不染色的精子細胞為活體細胞
11．將1.5毫升離心管放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
12．小心抽掉上清液
13．加入xx微升清理液（Reagent B），混勻
14．放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
15．小心抽掉上清液
16．加入xx微升固定液（Reagent C），混勻
17．室溫下孵育60分鐘
18．放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為600g（或2500RPM，例如EPPENDORF 5415）
19．小心抽掉上清液
20．加入xx微升清理液（Reagent B），混勻
21．即刻移取12微升到潔凈的載玻片一端
22．用蓋玻片或另一個載玻片推片
23．置于空氣中涼干
24．小心加上xx微升二染液（Reagent D）在載玻片上，覆蓋樣品表面
25．放進40℃恒溫培養(yǎng)箱孵育5分鐘
26．即刻移去二染液（Reagent D）
27．小心加上xx微升清理液（Reagent B）在載玻片上，覆蓋樣品表面
28．即刻移去清理液（Reagent B）
29．小心加上xx微升三染液（Reagent E）在載玻片上，覆蓋樣品表面
30．室溫下孵育30分鐘
31．即刻移去三染液（Reagent E）
32．小心加上xx微升清理液（Reagent B）在載玻片上，覆蓋樣品表面
33．即刻移去清理液（Reagent B）
34．封片
35．即刻在一般光學(xué)顯微鏡下（1000倍；即油鏡下）觀察并計數(shù)（注意：每個視野計數(shù)200個精子）
粉紅色頂體和淺棕色頂體后區(qū)――活體精子未反應(yīng)完整頂體
無色頂體和淺棕色頂體后區(qū)――反應(yīng)后頂體（或頂體缺失）――陽性頂體反應(yīng)
藍色精子細胞、粉紅色頂體和淺棕色頂體后區(qū)――死亡精子未反應(yīng)完整頂體
無色頂體和無色頂體后區(qū)――死亡或凍存后、損傷后精子退化頂體（或頂體缺失）
注意事項
1． 本產(chǎn)品為50次操作
2． 操作時須戴手套
3． 樣品檢測前，建議在血細胞計數(shù)器上進行精子細胞計數(shù)，同時觀察精子游動
4． 精子細胞計數(shù)時乘上稀釋倍數(shù)104。標準血細胞計數(shù)器（Hemocytometer）的計算方法是：
1毫米方塊的細胞計數(shù)X 104（稀釋倍數(shù)）＝實際細胞數(shù)/毫升
5． 避免一染液（Reagent A）染色時間超過15分鐘，否則由于其毒性導(dǎo)致精子細胞死亡
6． 本產(chǎn)品可用于染色稀釋過的或凍存過的精子細胞
7． 本公司提供系列發(fā)育生物學(xué)相關(guān)檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定著色清晰