脂肪酸β氧化速率比色法檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書

主要用途

脂肪酸β氧化速率（β oxidation rate）比色法檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)棕櫚酰肉堿氧化依賴性鐵氰化物還原，即單位時(shí)間還原產(chǎn)物的峰值降低，即采用比色法來(lái)測(cè)定線粒體裂解樣品中脂肪酸β氧化速率的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞、組織中線粒體裂解懸液樣品（動(dòng)物、人體等）脂肪酸β氧化速率的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

脂肪酸β氧化過(guò)程（β-oxidation）在動(dòng)物組織的線粒體發(fā)生的脂肪酸代謝通路，可概括為活化、轉(zhuǎn)移、β氧化及后經(jīng)三羧酸循環(huán)被*氧化生成CO2和H2O，并釋放能量等四個(gè)階段，是體內(nèi)，尤其是組織器官，例如肝臟、心臟和骨骼肌等能量?jī)?nèi)平衡的關(guān)鍵代謝通路。食物中甘油三酯提供體內(nèi)三分之一的能量供給，骨骼肌和心臟消耗80%的總能量。脂肪酸代謝異常，將導(dǎo)致脂質(zhì)聚集在非脂肪組織內(nèi)，產(chǎn)生慢性病的病理基礎(chǔ)，例如糖尿病、心衰、肥胖癥等。其中β氧化，包括脫氫、水合、二次脫氫和硫解，是將活化的各種長(zhǎng)度脂酰輔酶酯（acyl CoA esters）不斷縮短為乙酰輔酶A（acetyl CoA）單位，后經(jīng)過(guò)三羧酸循環(huán)和呼吸鏈氧化成CO2和水。脂?；o酶A脫氫酶（acyl CoA dehydrogenase；AD；EC.1.3.99.3）是脂肪酸代謝進(jìn)入β-氧化后工作的重要酶之一。通過(guò)底物棕櫚酰肉堿（palmitoyl carnitine）的氧化產(chǎn)生的電子，由鐵氰化物（ferricyanide）捕獲而還原，其還原速率的檢測(cè)，來(lái)評(píng)價(jià)β氧化的速率，即吸光值（420nm波長(zhǎng)）的下降與時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A）  20毫升

反應(yīng)液（Reagent B）   2毫升

底物液A（Reagent C）   1毫升

底物液B（Reagent D）   1毫升

陰性液（Reagent E）     1毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書      1份

保存方式

保存反應(yīng)液（Reagent B）、底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)操作的容器

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如純化線粒體），至于冰槽里備用
• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)420nm和470nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液A（Reagent C）和底物液B（Reagent D）避免光照
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

• 背景對(duì)照測(cè)定

• 移取750微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入50微升底物液A（Reagent C）
• 加入50微升底物液B（Reagent D）

• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照【（OD420—OD470）0分鐘－（OD420—OD470）5分鐘】

• 樣品測(cè)定

• 移取750微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入50微升底物液A（Reagent C）
• 加入50微升底物液B（Reagent D）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測(cè)樣品（500微克線粒體蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)【（OD420—OD470）0分鐘－（OD420—OD470）5分鐘】 

四、計(jì)算氧化速率

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.5（樣品質(zhì)量；毫克）X 105（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝微摩爾鐵氰化物還原/分鐘/毫克

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定
• 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)5分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有氧化功能
• 建議待測(cè)樣本線粒體蛋白濃度為500微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 本公司提供系列脂肪酸代謝檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感